做什么样子？western blot需要什么？

westernblot什么技术和Westernblot需要准备哪些试剂和耗材？11细胞②吸出PBS，加入裂解液(碧云天)P0013；贴壁细胞：去除培养液PBS、再次清洗生理盐水或无血清培养液(如果血清中的蛋白质不受干扰，可以不洗)。

做westernblot需要什么，如何快速掌握实验小白？WesternBlot相关实验

了解WesternBlot学会选择合适的实验过程WB对实验结果进行抗体分析。让我们一起学习吧.

westernblot是什么技术和Westernblot需要准备哪些试剂和耗材？

①将细胞培养皿放在冰上，冷却PBS洗涤细胞2次

②吸出PBS，加入裂解液(碧云天)P0013；1%TritonX-100；）

a.融解Western及IP细胞裂解液，混合均匀。取适量裂解液，使用前几分钟内加入PMSF，使PMSF最终浓度为1mM，或根据实验需要添加适当的蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。取适量裂解液，使用前几分钟内加入PMSF，使PMSF最终浓度为1mM，或根据实验需要添加适当的蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

b.贴壁细胞：用于去除培养液PBS、再次清洗生理盐水或无血清培养液(如果血清中的蛋白质没有干扰，就不能清洗)。裂解液按6孔板每孔100-200微升裂解液的比例加入。用枪吹几下，使裂解液与细胞充分接触。裂解液通常在接触动物细胞1-2秒后裂解。（一般10*7个细胞用100ul裂解后获得的上清蛋白浓度约为2-4mg/ml）

③用刮刀刮掉贴壁细胞，转移到EP管，rpm离心5分钟

④将上清液转移到EP管，负20℃保存

①将组织样品剪成细小碎片（最好在冰上进行）

c.裂解液按每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入。(如果裂解不足，可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白质样品，可以适当减少裂解液的用量。(如果裂解不足，可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白质样品，可以适当减少裂解液的用量。

d.用玻璃匀浆器匀浆，直至完全裂解。如果组织样品本身很小，可以在适当剪切后直接加入裂解液，通过强涡旋使样品完全裂解

（每20mg冻结的小鼠肝组织在200微升本裂解液裂解后得到上清，其蛋白质浓度约为15-25mg/ml，不同状态的组织不同)

③充分裂解后，-g离心3-5分钟，取上清

2.蛋白定量（Thermo)

2.1稀释白蛋白(BSA)制备标准液

2.2制备BCA工作液（A液：B液=50:1密闭室温可保存一段时间。

总体积=（#标准孔 #未知孔）#复孔每个样本的体积

测试管每管2ml;96孔板每孔200ul。

①将25ul按样品设置标准液和样品复孔加96孔板：BCA加入工作液(1:8)200ul

BCA工作液(如果样本有限，则添加10ul按样品浓度，可提前稀释5-10倍)

②最好摇匀30秒，将96孔板37秒℃孵育30min

③562nm，所有样钟内测试所有样本。

④所有样本减去空白控制在562nm绘制标准曲线，确定样品浓度

3.变性和还原蛋白质

在蛋白质样品中加入含量SDS上样缓冲液(确保样品中所有蛋白质带电荷一致)，100℃加热煮沸。

3.1.室温溶解蛋白上样缓冲液(5)×），按照4uL蛋白样品 1ul(5×)混合比例。

3.1.2100℃或将沸水浴加热10分钟，以充分改变蛋白质

3.1.3冰上骤冷，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔即可

3.1.电泳通常可以停止在电泳到达胶水底部附近的蓝色染料

4.SDS-PAGE凝胶电泳

4.根据目的蛋白的大小，选择和制备1胶选择合适的分离胶浓度)

4.配胶(碧云天P0012AC）

将玻璃板清洗干净，装板加水检漏，晾干装在制胶架上。按配方配胶。

(配胶顺序:先配分离胶(下胶)，再配浓缩胶(上胶)

4.2.2.制备浓缩胶(上胶)

4.2.3组装制胶器

①将准备好的分离胶倒入胶合板中(缓慢无气泡)，然后慢慢加入适量的异丙醇压平分离胶。

②分离胶凝结20-30分钟，倾斜板，倒异丙醇，吸水纸吸去残留液体，放弃上层压胶的水或醇。

②分离胶凝结20-30分钟，倾斜板，倒异丙醇，吸水纸吸去残留液体，放弃上层压胶的水或醇。

③将准备好的浓缩胶倒入制胶板中，然后插入梳子，20-30分钟浓缩胶即可凝结。

④慢慢取出梳子，上样。

4.2.4上样及电泳

①溶解在蛋白冰上，调整蛋白质浓度和等量5×上样缓冲液混合，即为上样液。用纯水冲洗胶合板，放入电泳池

②将电泳液倒入两块板之间，确认无漏液

③迅速拔出梳子，用枪轻轻吹出碎片

④依次添加蛋白质marker以及蛋白质样品，每孔20个样品ug，留一孔预染marker.加满电泳缓冲液，盖上槽盖，连接电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后，将其改为90V恒压电泳，指示器到达凝胶下端约0.5cm关闭电源，取出胶板。(上样时间尽量短，避免样品扩散，但不能过快避免样品溢出造成相邻加样孔的交叉污染，在未加样孔中加入等量样品缓冲液)

⑤调整电泳的电压和时间，传统胶是上胶80V，30min;下层胶120V90-120min.

(为防止蛋白带再凝胶上扩散，电泳后应尽快转膜)

通过电流将蛋白质凝胶中的蛋白质转移到转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎，蛋白带容易在凝胶中扩散，抗体不易进入凝胶与目的蛋白结合，因此需要在转印膜等固相载体上实现后续的封闭、清洗、颜色显示等实验操作。

①将减好的PVDF膜用无水甲醇湿润30秒以上，然后用ddH2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后续操作开始

②装配转膜三明治结构(在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡)

黑面(负极)→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面(正极)，每层之间不能有气泡。然后将三明治转移到电泳池，黑面对黑面。然后将三明治转移到电泳池，黑面对黑面。

跑westernblot我已经调整了上样量。为什么我的内参还跑不均匀？

一般来说，内参的定义是，正常样品中的分子相对稳定。
因此，在实验中做好阳性对照和阴性对照，然后保持与试验处理样品相同的样品量，然后对其进行测试pvdf膜可以通过剪切和孵化分别抗体(内参抗体和目标蛋白的特异性抗体)。