常规样规样本保留时间(一篇文章带你了解常用的粪便保存方法)

常规样本保留时间：一篇文章带您了解常用的粪便保存方法

掌握基因科技核心技术

近年来，随着对肠道微生物研究的逐步深入，大量研究表明，肠道微生物紊乱会导致肥胖、糖尿病、粥样动脉硬化和癌症等代谢性疾病。在目前对肠道微生物组的研究中，由于粪便样本的可获得性，已成为研究肠道微生物的首选样本。通过提取粪便标本中的细菌DNA，高通量测序是了解肠道菌群多样性和组成的重要环节。但粪便中的细菌DNA稳定性差，暴露在空气中或高温环境中容易降解。因此，粪便样品的储存非常重要。以下是几种保存粪便的方法，即冷冻保存法、冷藏保存法和保存液保存法。你想知道这些方法的秘密吗？粪便样品的储存特点是什么？

肠道菌群紊乱引起的一系列疾病冷冻保存法传统采用冷冻法保存粪便，即粪便收集后储存-20℃或-80℃温度，在-80℃在温度下冷冻被认为是保存粪便的最佳方法（金标准）。该方法集到的粪便-80°C在温度下，细菌在低温下的代谢率会降低，从而在一段时间内维持粪便中细菌的组成，从而稳定其微生物组成。粪便收集后立即收集（运输时间不超过）30min）放入-80℃冷冻可维持粪便菌群的原始结构和组成长达6个月[1]。在实际研究中，不容易立即冷冻收集到的新标本，大多数样本会在室温或其他环境中暴露一段时间。如果保存不当，细菌DNA降解会降低标本中菌群的种类和多样性，严重影响最终实验结果。

干冰可冷冻保存

低温冷藏在低温条件下使用(主要是4°C条件)可以减少细胞内核酸内切酶的活性，避免DNA被快速降解的原理来保存粪便。在4°C储存24小时不会显著改变粪便微生物群落结构[2]。临床实验中，由于实验人员无法立即将待分析的粪便样本放入-80℃冰箱保存，特别是在将样品转移回实验室的过程中，使用4°C冷藏箱或是0°C冰袋保存样品是一种可用的方法。这大大提高了患者粪便样品临床保存的灵活性。一旦到达实验室，建议立即将样品转移到-80℃长期保存冰箱

由于新鲜粪便样品难以获得，且难以实现快速低温冷冻，因此冰块满足了低温储存储存方法。随着技术的发展，储存液广泛应用于室温下样品的采集、储存和运输。粪便储存液种类繁多，常用储存剂有：常规粪便样品保留时间

乙醇、RNAlater、以及EDTA盐和柠檬酸钠。RNAlater它广泛应用于实验研究中。以下是一些简要介绍。乙醇溶液作为一种常用的固定剂，能迅速渗透细胞，凝固降解DNA不损伤相关酶DNA，从而达到更好的保存效果。文献显示，95%的酒精是在室温下短时间保存粪便样品的好选择，可以保证肠道微生物的组成和结构在室温下4天内不会发生显著变化[3]。另一项研究发现，75%的酒精可以在5个月内保持粪便中的微生物DNA的完整性，100酒精可以延长到8个月[4]。不难看出，酒精浓度越高，对于酒精浓度越高DNA保存效果越好。如果用酒精保存粪便样品，可以使用95%以上浓度的酒精，可以保证菌群结构和组成在8周内不会发生显著变化[5]。但乙醇也不方便携带，因为它是长途运输中的违禁品。RNAlater它是一种水、无毒的储存试剂，能抑制细菌生长，无液氮冷冻粪便样品，能迅速渗透组织，不仅能稳定和保护未冷冻标本中的细胞RNA，还能防止DNA降解。研究表明RNAlater大猩猩粪便微生物可以更好地保存溶液DNA长达7年[6]。人类微生物组计划（HumanMetagenomeProject)也将RNAlater作为指定的粪便DNA保存溶液[7]。

RNAlater此外，一些研究还将用于细胞的传统低温保护剂应用于粪菌的低温保存，甘油更为常用。甘油可以在-20°C~-80°C避免水结冰对细胞造成冰晶损伤，并能保持微生物活性，对粪便细菌移植具有重要意义。研究发现，用于治疗复发性困难梭菌感染的粪便细菌微生物可以在10%甘油中安全冷冻至少6个月，不会失去临床效果或活力，在临床治疗中发挥重要作用[8]。

[1]CarrollIan-M.,Ringel-kulkaTamar,SiddleJennica-P.CharacterizationoftheFecalMicrobiotaUsingHigh-ThroughputSequencingRevealsaStableMicrobialCommunityduringStorage[J].PLoSONE,2012,7(10):0.

[2]TedjoDI,JonkersDM,SavelkoulPH,MascleeAA,vanBestN,PierikMJ,PendersJ.Theeffectofsamplingandstorageonthefecalmicrobiotacompositioninhealthyanddiseasedsubjects.PLoSOne.2015May29;10(5):e0126685.doi:10.1371/journal.pone.0126685.PMID:26024217;PMCID:PMC4449036.

[3]Loftfield,E.,E.Vogtmann,J.N.Sampson,S.C.Moore,H.Nelson,R.Knight,N.Chia&R.Sinha(2016)ComparisonofCollectionMethodsforFecalSamplesforDiscoveryMetabolomicsinEpidemiologicStudies.CancerEpidemiolBiomarkersPrev,25,1483-1490.

[4]李娜、李迪强、王秀磊等.不同的动物基因组粪便保存方法DNA影响提取效果[J].2006、29(5)国际遗传杂志:341-345

[5]Song,S.J.,A.Amir,J.L.Metcalf,K.R.Amato,Z.Z.Xu,G.Humphrey&R.Knight(2016)PreservationMethodsDifferinFecalMicrobiomeStability,Affecting

[6]DrakulovskiP,LocatelliS,ButelC,PionS,KrastevaD,Mougdi-PoleE,DelaporteE,PeetersM,MalliéM.UseofRNAlaterasapreservationmethodforparasiticcoprologystudiesinwild-livingchimpanzees.ExpParasitol.2013Oct;135(2):257-61.doi:10.1016/j.exppara.2013.07.002.Epub2013Jul11.PMID:23850999;PMCID:PMC3907073.

[7]HumanMicrobiomeProjectConsortium.Aframeworkforhumanmicrobiomeresearch.Nature.2012Jun13;486(7402):215-21.doi:10.1038/nature11209.PMID:22699610;PMCID:PMC3377744.

[8]CostelloSP,ConlonMA,VuaranMS,Roberts-ThomsonIC,AndrewsJM.FaecalmicrobiotatransplantforrecurrentClostridiumdifficileinfectionusinglong-termfrozenstooliseffective:clinicalefficacyandbacterialviabilitydata.AlimentPharmacolTher.2015Oct;42(8):1011-8.doi:10.1111/apt.13366.Epub2015Aug11.PMID:26264455.